Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана Кэри Муллисом в 1983 году, который впоследствии был удостоен Нобелевской премии. На сегодняшний день метод ПЦР стал одним из ключевых подходов в выявлении инфекционных болезней.
ПЦР представляет собой технологию молекулярной биологии, цель которой — значительное увеличение количества специфических участков ДНК в исследуемом материале. Это достигается благодаря последовательному удваиванию целевых сегментов ДНК с использованием специальных ферментов в контролируемых лабораторных условиях. В результате процесса амплификации создаётся достаточное число копий ДНК для их последующего обнаружения. При этом удваиваются исключительно выбранные участки, при наличии их в образце.
Кроме увеличения количества копий ДНК, ПЦР-анализ предоставляет возможность выполнения множества манипуляций с генетическим материалом, включая добавление изменений в структуру ДНК и соединение её отдельных фрагментов. Этот метод широко используется не только для диагностики различных болезней, включая наследственные и инфекционные, но и для определения отцовства, клонирования генов, внесения мутаций и выявления новых генов.
Применение полимеразной цепной реакции
ПЦР установил себя как "золотой стандарт" в диагностике большинства инфекций, зарекомендовав себя высокой надёжностью в клинической практике. Этот метод позволяет выявить возбудителей болезней даже при их низком содержании в образцах.
Методика особенно эффективна для диагностики тех инфекций, которые развиваются медленно и не требуют сложных микробиологических анализов. Она нашла своё применение в области гинекологии и урологии для обнаружения ИППП.
Высокочувствительный ПЦР-тест способен выявлять заболевания, такие как гепатиты, ВИЧ, коронавирус COVID-19 и другие, даже при высокой вариабельности антигенов. Специфичность метода при использовании ПЦР технологии может достигать 100% для обнаружения вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и других бактериальных инфекций. Эта методика способна выявлять даже отдельные клетки патогенов, что невозможно при помощи других подходов.
ПЦР-диагностика особенно ценна при поиске микроорганизмов, которые трудно или вовсе невозможно культивировать, что часто встречается при латентных и хронических инфекциях. Она позволяет обходить сложности, связанные с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
Направления медицины где широко применяется этот метод:
Урология и гинекологии - выявление хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза и других инфекций.
Пульмонология - дифференциальная диагностика вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза.
Гастроэнтерологии - обнаружение хеликобактериоза.
Клиника инфекционных заболеваний - диагностика сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов B, C и G.
Гематология - обнаружение цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.
Проведение теста
Для работы метода в минимальном наборе требуется набор компонентов:
- ДНК-матрица, содержащая необходимый фрагмент для амплификации.
- Два праймера*, которые комплементарны концам целевого фрагмента ДНК.
- Термостабильная ДНК-полимераза.
- Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTPs) - A, G, C, T.
- Ионы Mg2+, необходимые для активности полимеразы.
- Буферный раствор.
ПЦР проводится в термоциклере - устройстве, которое обеспечивает циклическое изменение температуры материала. Добавление масел и специфических ферментов может увеличить эффективность ПЦР-реакции.
Процесс включает в себя от 20 до 35 этапов, каждый из которых проходит через три фазы.
Разделение цепей: Для разъединения двойной спирали ДНК её нагревают до температуры 94-96°C (или до 98°C при использовании полимеразы с высокой термостойкостью) на промежуток времени от 30 секунд до 2 минут. Этот этап называется денатурацией и предназначен для разрушения водородных связей между цепочками ДНК. Иногда перед началом циклов осуществляют дополнительный нагрев смеси в течение 2-5 минут для гарантии полной денатурации исходной ДНК и стартовых фрагментов.
Спаривание: Далее снижают температуру, чтобы стартовые фрагменты ДНК могли прикрепиться к одноцепочечной ДНК. Температура этой фазы подбирается на 4-5°C ниже температуры плавления стартовых фрагментов и длится от 30 секунд до 2 минут.
Синтез: В это время фермент ДНК-полимераза начинает синтезировать новую цепь ДНК, исходя из прикреплённого стартового фрагмента. Температура для этой фазы выбирается в зависимости от используемой полимеразы, чаще всего она равна 72°C. Продолжительность синтеза определяется длиной удваиваемого участка ДНК и обычно составляет примерно одну минуту на тысячу пар оснований. По завершении всех циклов может проводиться дополнительный этап синтеза на 10-15 минут для полной дубликации всех фрагментов ДНК.
Сбор и доставка образцов для анализа
Для получения достоверных результатов диагностики критически важно корректно собрать и подготовить образец. Ошибки на этапе подготовки проб для лабораторного анализа возникают часто – вплоть до 70% случаев. В лаборатории Helix для забора крови применяются вакуумные системы, которые сводят к минимуму травматизацию пациента и исключают прямой контакт собранного материала с медицинским персоналом и окружающей средой. Это предотвращает загрязнение образца и способствует точности исследования методом ПЦР.
*Стартовый фрагмент (праймер) – это короткий участок ДНК, который используется для начала синтеза новой цепи на матрице. Каждый праймер комплементарен определённой цепи двойной спирали ДНК, указывая на начало и конец участка, подлежащего удвоению.
